ELISA克隆試劑盒

發布時間： 2011/4/26　　點擊次數： 806次

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ELISA克隆試劑盒

1 原理：
ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。測定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重復性好。
ELISA 常用的酶和底物
辣根過氧化物酶，底物為OPD, 深桔，檢測波長492nm
TMB，藍綠色，檢測波長450nm
堿性磷酸酶，底物為PNPP（對－消基苯磷酸酯）,
檢測波長405nm
ELISA各步驟的反應時間
包被：24－36h，蛋白濃度為1－5ug/ml
封閉：37ºC 2h 或4ºC過夜（3％BSA）
樣本反應時間：37ºC 45min-1h
酶標抗體反應時間： 37ºC 45min-1h
顯色時間：15min（避光）
設對照
可以一次包被多塊板，凍存備用
2 類型
（1）間接法測抗體
間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體，檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法。
常用于臨床血清中自身抗體的檢測，以及雜交瘤上清特異性抗體的篩選。如血清中PDCD5自身抗體的檢測。

（2）雙抗體夾心法測抗原
是檢測抗原zui常用的方法。
只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結合物。
常用的組合：單克隆抗體＋多克隆抗體
單克隆抗體＋單克隆抗體
后一組合是兩種單克隆抗體針對抗原上不同的相距較遠的兩個抗原決定簇，分別用于包被固相載體和制備酶結合物。
用途：測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。例如各種細胞因子的檢測。

雙抗體夾心法測抗原的方法：
捕獲抗體包被→封閉（3％BSA）→待測抗原→洗滌（含0.1％Tween的PBS）→酶標單抗或多抗→洗滌→顯色→檢測
（3）競爭法測抗原
1）抗體固相測抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。
其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，zui后的顯色也愈淺。
方法：抗體包被→封閉→同時加入待測抗原和酶標抗原→洗滌→酶底物→顯色→ELISA reader檢測
2）抗原固相測抗原
其原理是標本中的抗原和固相抗原與一定量的抗體競爭結合。標本中抗原含量愈多，結合在固相上的抗體愈少，zui后的顯色也愈淺。
方法:
a: 抗原包被96孔板； b:封閉;
c: 待測抗原與抗體反應一定時間； d: 加入96孔板
e: 洗滌 f：加入酶標二抗
g：洗滌 h：顯色和檢測

（4）IgM抗體的檢測
1）間接法：
間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定血清中的IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，后者將競爭結合固相抗原而使一部分IgM抗體不能結合到固相上，將出現假陰性結果。因此，如果用抗IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。
方法：
a: 抗原包被96孔酶標板； b:封閉;
c: 待測血清與A蛋白反應一定時間后離心
d: 吸取上清液加入96孔酶標板
e: 洗滌 f：加入酶標抗IgM的抗體
g：洗滌 h：顯色和檢測
2）捕獲包被法（夾心法）
先用抗人IgM抗體包被ELISA板，以捕獲血清標本中的IgM（包括針對抗原特異性的IgM和非特異性的IgM）。然后加入相應抗原，繼而加入針對抗原特異的酶標抗體，再與底物作用，顏色的深淺即與標本中的IgM含量成正相關。
方法：
a: 抗人IgM抗體包被96孔酶標板； b:封閉;
c: 加入待測血清； d: 洗滌96孔酶標板
e: 加入相應抗原 f：加入抗原特異的酶標抗體
g：洗滌 h：顯色和檢測
（5） ABS-ELISA技術（Avidin Biotin system-ELISA
原理
親和素是一種分子量是60，000的堿性蛋白，由四個相同亞基組成，每個亞基有一個生物素分子結合點。兩者均可與抗體等大分子生物活性物質相偶聯，又可被酶類等多種材料所標記，成為一種生物反應放大系統。生物素化抗體可捕獲多個親和素，后者再與酶結合，加入底物后，產生顏色反應。這一系統可以大大提高ELISA的靈敏度。
操作過程：
抗原包被→封閉→待檢標本→生物素化抗體→洗滌→ 酶標記親和素→洗滌→加底物顯色和檢測

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